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Già consapevole delle proprie capacità, rifiuta la prima ammissione alla Scuola Normale Superiore di Parigi, in quanto solo quindicesimo nella lista; al secondo tentativo guadagna il terzo posto ed accetta l'ammissione. Per il dottorato di ricerca, presenta due tesi, in chimica e in fisica, entrambe sviluppate nel campo della cristallografia. Pasteur diventa professore di chimica alla Facoltà di Strasburgo, ma ottiene un permesso speciale da parte del Ministro dell'Educazione, per allontanarsi temporaneamente dall'impiego e dedicarsi esclusivamente ai suoi studi. Presenta infatti all'Accademia delle Scienze di Parigi, il suo elaborato sulla cristallografia; ha appena scoperto l'influenza della struttura molecolare sulla deviazione della luce polarizzata, osservando la forma dei cristalli di tartaro e paratartaro : Pasteur arriva alla conclusione che l'acido paratartarico (insieme di acido tartarico destro e acido tartarico sinistro), dopo fermentazione, diventa attivo sulla luce polarizzata.
Durante quindici anni di ricerche, Pasteur scopre il ruolo dei microorganismi nelle fermentazioni, arrivando a classificare gli esseri viventi microscopici (da lui denominati "fermenti") in due grandi categorie : aerobici (che non possono vivere senza ossigeno) ed anaerobici (che possono vivere in assenza di ossigeno)
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Grazie a queste scoperte fu possibile elaborare sistemi efficaci di eliminazione dei microrganismi dannosi, che rappresentavano un grave problema economico per l'industria vinicola e della birra. L'estensione di queste ricerche ai problemi di conservazione del latte lo portarono a ideare il processo, oggi conosciuto con il nome di pastorizzazione, che consente di uccidere i microrganismi dannosi eventualmente presenti nel latte, portando il liquido a 60-70° C per breve tempo prima dell'imbottigliamento
. Nel 1865, a Parigi , di fronte ad una epidemia che aveva colpito i bachi da seta, riuscì a dimostrare la natura contagiosa ed ereditaria della malattia e ne indicò i metodi di prevenzione.
Gli studi sulla fermentazione e sulla generazione spontanea ebbero importanti ripercussioni in medicina.
Negli anni '80 si dedicò allo studio del carbonchio, una malattia del bestiame spesso fatale e ne isolò il bacillo responsabile. Studiò i sistemi di prevenzione di numerose malattie: setticemia, colera difterite, tubercolosi e vaiolo, rabbia. Per la prevenzione della rabbia riuscì a sviluppare una forma attenuta del virus responsabile utilizzabile come vaccino che ha salvato migliaia di persone.
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